深圳PCR實驗室規(guī)劃設(shè)計

污染，是PCR實驗室出現(xiàn)實驗假陽性、結(jié)果不可信、研發(fā)不可靠的重要推手，PCR實驗室應(yīng)當(dāng)將防污染作為日常管理、實驗安排、清潔消毒、實驗習(xí)慣的核心。PCR 實驗污染和細(xì)胞污染是有差別的，PCR 實驗污染主要是核酸而不是細(xì)菌和其他入侵者。因此所有的預(yù)防措施都會稍稍有所不同。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，我們該如何應(yīng)對。今天給大家簡單介紹一下PCR實驗室的主要污染來源、實驗中如何避免和減少污染的可能性及實驗發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。
 
PCR實驗室的污染來源
 
1、標(biāo)本間交叉污染：
收集樣本的容器被污染或標(biāo)本密封不嚴(yán)外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。
 
2、實驗試劑污染：
主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風(fēng)險的。
 
3、擴增產(chǎn)物污染：
大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是 PCR 反應(yīng)中主要的常見污染問題。因為 PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
 
4、克隆質(zhì)粒污染：
作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
 
1、嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：
 
試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。
 
標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。對于涉及臨床標(biāo)本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護(hù)設(shè)備、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。
 
擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。
 
擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
 
試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴增區(qū)內(nèi)的實驗用品，包括移液器等器具應(yīng)，空氣、物品流向依次為：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。
 
2、清潔的實驗用品：
實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實驗耗材應(yīng)一次性使用。
 
3、正確的實驗操作：
實驗應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，工作臺內(nèi)應(yīng)放置PCR的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。
 
實驗的過程中選擇合適尺寸的手套并能及時更換，在進(jìn)出不同實驗區(qū)域或進(jìn)行模板操作后都應(yīng)更換實驗服、口.罩、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染。
 
裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險；謹(jǐn)慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。
 
吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。
 
PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)；多樣本PCR反應(yīng)時，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現(xiàn)*閉管操作。
 
實驗試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。
 
PCR擴增實驗完成后及時將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
 
4、規(guī)范的實驗設(shè)計：
應(yīng)遵循實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實驗中設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質(zhì)控實驗過程，驗證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
 
PCR實驗室的污染應(yīng)急處理方法
 
1、若核酸標(biāo)本溢出：
立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。
 
2、其他不明情況污染：
1、暫停所有實驗操作；
2、清理實驗室內(nèi)所有物品，尋找污染來源；
3、加大實驗室的通風(fēng)；
4、對實驗室內(nèi)所有表面（臺面、地面及墻面） 進(jìn)行消毒；
5、75%酒精空中噴霧；
6、開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）；
7、以上措施每日進(jìn)行，直至污染消除；用新試劑及確認(rèn)無污染的器材進(jìn)行原污染項目的試劑空白檢測，連續(xù)3次均陰性后方可進(jìn)行常規(guī)檢測。
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